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酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定傷寒桿菌“O”抗體
  • 發(fā)布日期:2009-06-16      瀏覽次數(shù):2014
    • 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是用酶標(biāo)記的抗體(或SPA)檢測(cè)未知抗原或抗體的方法。此法敏感性高,特異性強(qiáng)。常用的是ELISA方法,間接法,雙抗體法和抗原法。本次試驗(yàn)介紹,酶聯(lián)葡萄球菌蛋白A免疫分析法。ELISA法原理如下,見(jiàn)圖9

      1.加抗原使之吸附于固相載體(如塑料反應(yīng)板)
      2.洗滌加待測(cè)血清
      3.洗滌加酶標(biāo)記SpA
      4.洗滌加酶的底物。經(jīng)酶的催化產(chǎn)生有色產(chǎn)物。

       

      材料:
      1.聚乙烯塑料反應(yīng)板(PH9.6時(shí)可吸附蛋白Ag)
      2.抗原:傷寒桿菌O901煮沸或超聲波粉碎抗原
      3.待測(cè)血清
      4.凍干酶聯(lián)葡萄球菌A蛋白(HRD—proteinA)純品
      5.鄰苯二胺(OPD)
      6.包被液:0.05M碳酸鈉—碳酸氫鈉溶液PH9.6
      7.稀釋液:10%免疫血清PBS—吐溫20,防止非特異性吸附
      8.洗滌液:0.02MTrisTWeen20,Ph7.4防止非特異性吸附
      9.底物溶液:0.02M磷酸氫二鈉25.7毫升
      0.1M檸檬酸24.3毫升
      蒸餾水50毫升
      臨用前新鮮配制,在上述緩沖液中溶解40毫克鄰苯二胺,然后加入30%雙氧水0.15毫升,底物對(duì)光敏感,需要避光并立即使用。
      10.終止液;2M硫酸
      方法:
      1.抗原包被
      取潔凈的聚苯乙烯微量反應(yīng)板,于每孔內(nèi)加傷寒抗原0.1毫升(用包被緩沖液稀釋?zhuān)鞍缀?0微克/毫升),置37℃1小時(shí),棄抗原液,用洗滌液3次每次3分鐘。
      2.加待測(cè)血清
      于每孔內(nèi)分別加不同稀釋度(如1:5,1:10,1:20…1:80)的待測(cè)血清,PBS空白對(duì)照,陰性對(duì)照血清,陽(yáng)性對(duì)照血清各0.1毫升。置37℃30分鐘,洗滌3次。
      3.加酶聯(lián)A蛋白
      于每孔加酶聯(lián)A蛋白各0.1毫升,置37℃20分鐘,洗滌3次。
      4.加臨時(shí)配制的底物溶液各0.1毫升,置暗處15分鐘。加2M碳酸1滴終止反應(yīng)。
      5.結(jié)果判斷:(肉眼判斷)
      若顏色于陰性對(duì)照相同則為陰性,若較陰性對(duì)照深則為陽(yáng)性,根據(jù)顏色深淺以( )表示。

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